Seznámení s obyvateli. Návod: Jak si doma vypěstovat vlastní mikrobiotu

Je v nás třikrát více buněk mikrobioty, než je buněk, ze kterých se ve skutečnosti skládáme. Bakterie žijí všude: v ústech, nosu, uších, střevech, plicích – a dokonce i v očích. Psali jsme o tom, kdo nám bydlí pod víčky, a nyní jsme se rozhodli podívat se na tyto nájemníky. Nechali jsme si od šéfredaktora odebrat Petriho misky, elektrický radiátor, mikroskop, médium pro růst bakterií a nějaké vzorky mikrobiomu. N+1 Ilja Ferapontov. Trocha laboratorní magie – a zjistili jsme, že kokci žijí v Iljově oku Staphylococcus epidermidis. Podrobně říkáme, jak lze podobný experiment opakovat doma.

Co potřebujete

1. Petriho misky, 5-10 kusů
2. Agar
3. Lysogenní živné médium LB
4. Glukóza
5. Mikrobiologické smyčky
6. Rukavice a maska
7. Kuchyňské váhy nebo alespoň aplikaci „váha“ ve vašem smartphonu
8. Kuchyňský sporák

Položky z bodů 1-5 můžete získat pouhým nákupem

pro školní laboratorní práci: bude vás to stát asi 5 tisíc rublů.

Příprava živného média

1. Vezměte jakoukoli nádobu, jejíž objem znáte, a nalijte do ní vodu.
2. Nalijte do šálku LB rychlostí 25 gramů na litr.
3. Agar pošlete na stejné místo tak, aby jeho podíl v roztoku byl asi 1-2%.
4. Celou směs povařte (připravte např. v mikrovlnce), aby se agar rozpustil a poté nechte vychladnout.
5. Přidejte do roztoku glukózy rychlostí 360 miligramů na 100 mililitrů. Můžete udělat víc, ale v rozumných mezích. Můžete přidat kvasnicový extrakt: obsahuje růstové faktory, které některé bakterie potřebují.
6. Vše zahřejte až na 80 stupňů (zde budete potřebovat teploměr do trouby nebo jen digitální teploměr se sondou). Vše, prostředí je připraveno.

Řekněme si pravdu: tuto etapu jsme „hackli“ a použili pojmenované vybavení laboratoře Borise Fenyuka z Výzkumného ústavu fyzikálně-chemické biologie. A.N.Belozersky. Pro sterilizaci médií jsme použili autokláv a pro všechny ostatní přípravky digestoř s laminárním prouděním.

Přeneste médium do misky

Před nanesením média na povrch kalíšku je nutné jej sterilizovat – aby v kalíšku nerostlo nic navíc.

Existuje mnoho metod sterilizace, ale doma je nejúspěšnějším řešením zahřívání. Postačí otevřený plamen plynového hořáku nebo plotýnky – stačí sejmout víko z jeho horní části. Vertikální plameny ve výšce dlaně kolem sebe vytvářejí cyklický vír horkého vzduchu, který vám poskytuje „antibakteriální zónu“ o průměru asi dvacet centimetrů.

1. Vezměte Petriho misku a zahřejte ji na 80 stupňů – nebo ji jen ponořte do vroucí vody (pozor, abyste se neopařili!). Počkejte patnáct minut, než vychladne, a znovu zahřejte. Tento postup opakujte alespoň pětkrát (nebo vícekrát). Gratulujeme! Nyní máte sterilní povrch, na který můžete aplikovat kultivační médium.
2. Umístěte své Petriho misky vedle hořáku/hořáku, zapněte teplo a počkejte 5-10 minut.
3. Ještě horkým médiem naplňte Petriho misku, uzavřete a počkejte, až médium ztuhne. Nechte v kelímku trochu místa, neplňte kelímek až po okraj! Ztuhlé médium by mělo mít pevnou rosolovitou konzistenci.

Odebíráme vzorek

Vypěstovali jsme si mikrobiom oka, takže jsme použili očkovací smyčku na stěr – pokud se vám opravdu nechce lézt pod víčka (nebo někomu jinému), stačí ponořit prst do Petriho misky, pak budete přivést všechny mikroby, kteří na něm žijí.

1. Vezměte sterilní očkovací smyčku. Plastové se prodávají již sterilizované. Pokud máte kovovou smyčku, tak ji nejprve rozžhavte v plameni, ochlaďte dotykem na médium a hned natřete. Udělali jsme panu šéfredaktorovi výtěr z oka, nosu a úst N+1 plastová smyčka. Byli jsme opatrní a on nebyl zraněn.
2. Po rozmazání naneste dlouhý tah smyčkou na povrch Petriho misky bez přitlačení.
3. Nyní hrnek uzavřete a médium otočte dnem vzhůru. Kelímek by měl být vždy dnem vzhůru – tedy pevným médiem nahoru, aby na jeho povrch nepadaly kapky kondenzátu. Pro omezení vysychání můžete také zkusit utěsnit okraje kalíšku, ale tak, aby byla zachována minimální výměna vzduchu.

Je to důležité,: Od otevření až po uzavření šálku by všechny činnosti měly být prováděny přísně v „antibakteriální zóně“ hořáku, aby se v šálku neusazovaly zbytečné bakterie.

Teď už zbývá jen počkat, až se bakterie rozmnoží. V šálku musíte reprodukovat teplotu blízkou tělesné teplotě. Čím je tepleji, tím rychlejší bude růst. Zde se baterie hodí.

Trvá asi dva až čtyři dny, než vyrostou velké kolonie, ale během prvního dne budete s největší pravděpodobností na povrchu misky vidět malé hlenovité hrudky.

Pracovali jsme v chladné a dobře větrané místnosti, ve které neměly bakterie co jíst. Všechny nástroje a rukavice, ve kterých jsme pracovali, jsme také sterilizovali alkoholem. Abychom se ujistili, že je vše v pořádku, použili jsme negativní kontroly: jeden ze sektorů Petriho misky byl ponechán prázdný a druhý byl oset „prázdnou“ špachtlí. Díky tomu zůstaly čisté a nic v nich nerostlo. To znamená, že můžeme s čistým svědomím říci, že všechno, co v nás vyrostlo, vlastně kdysi žilo v oku.

kdo vyrostl?

Kvůli čistotě experimentu jsme odebrali několik výtěrů: jeden ze středu oka, druhý z jeho samého okraje, což naznačuje, že by to byla šance zachytit více různých druhů, kterých je zde již málo. oční mikrobiom.

Zpočátku jsme nemohli přimět žádné bakterie rostoucí v oku, aby rostly.

Ale výběrem podmínek – přidáním kvasinek do původního média, zvýšením množství glukózy, zvýšením tekutosti média – jsme uspěli.

Pokud vše proběhlo v pořádku (potřebovali jsme dva průchody pro první kolonie očí), pak se vám rozrostly bakterie. Chcete se podívat blíže? Vypadni z mikroskopu.

Pro zkoumání bakterií stačí zvětšení 600x, ale pro adekvátní obraz je stále lepší mít mikroskop 900x. Mnohé „školní“ mikroskopy to zvládnou.

Nyní otevřeme Petriho misku s našimi koloniemi.

Je to důležité,: Všechny bakterie, které pěstujeme, jsou oportunní, takže je nejlepší být opatrný. Abyste dodrželi bezpečnostní opatření, musíte nosit masku a rukavice.

Oportunní patogeny jsou přirozenými obyvateli různých biotopů lidského těla, způsobují onemocnění s prudkým snížením celkové nebo lokální imunity. Mezi ně patří například klíšťata Folikulární Demodex s demodikózou nebo houbou Candida albicans s kandidózou.

Otevřete pohár. Pravděpodobně ucítíte nepříjemný zápach – jde o odpadní produkty bakterií. Abychom viděli naše přátele, stačí jednoduchý přípravek „rozdrcená kapka“ – odeberte stěr z média, nařeďte jej kapkou vody a poté naneste na podložní sklíčko.

Nejlepší způsob, jak zjistit, co vyrostlo ve vaší misce, bez sekvenování, je porovnat vaše výsledky s vědeckými poznatky. Používejte výzkumné databáze a databáze článků, jako je PubMed.

Abychom se ujistili, že pěstujeme přesně oční mikroby, obrátili jsme se na nedávná data z metagenomiky očního mikrobiomu. Zahrnuje pouze deset systematických skupin a jsou zcela odlišné. To nám dalo příležitost vztáhnout to, co jsme byli schopni vypěstovat, k již známé oční fauně.

Nejprve jsme porovnali morfologii našich bakterií se všemi typy bakterií uvedenými v již zmíněném článku – a zjistili jsme, že morfologicky je velmi podobná koloniím S. epidermidis.

Za druhé, distribuce kolonií na misce byla velmi podobná metagenomickým datům. Na fotografii níže je vidět, že bakterií ze vzorku z okraje oka – které bylo potřeba ke stanovení počtu bakterií v očním hlenu – je méně než bakterií ve vzorku ze spojivkového vaku. To potvrzují i ​​data z metagenomické studie.